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本试剂盒是在包涵体微量纯化试剂盒的中量提取升级产品，用于中量、快速的从大肠杆菌宿主细胞中提取高质量的包涵体。

• 中量提取，一次可以处理30～50mL的菌液，一次中量提取相当于10～20次微量提取。
  
• 操作简单快速，整个过程只要四十分钟左右。
  
• 本制品主要用于从大肠杆菌宿主中纯化包涵体，也能用于真菌和其他表达系统，但纯化条件（主要是细胞裂解条件）需要自行优化。
  
• 能有效去除包涵体中的细胞壁和细胞膜等非重组蛋白成份，使重组蛋白所占比重达到60%以上。
  
• 本手册提供通过酶法裂解细胞和打断DNA的方案，反应更加温和。
  
• 得到的包涵体可以用于重折叠。
  
• 本制品足够5次中量纯化，每次可以处理30～50mL菌液。

一次中量提取需要5mL包涵体纯化溶液A，用前按每mL加入120mg溶菌酶的比例加入所需量的溶菌酶干粉并摇晃溶解待用。溶菌酶的溶液非常容易衰变，所以最好现配现用，没用完的只能在-20℃放一周。包涵体中的重组蛋白一般比溶解状态中的蛋白质更能够抵抗微量内源性蛋白水解酶的降解，如果实验发现得到的重组蛋白确有降解，则需要在包涵体纯化溶液A中新鲜加入自备的蛋白酶抑制剂混合物。

1. 在蛋白诱导期结束时，转移30=50mL菌液到一个干净的塑料离心管中。
   
2. 7000rpm室温离心3分钟，小心弃上清。
   
3. 加入5mL含120mg/mL溶菌酶的包涵体纯化溶液A重悬细胞。
   
4. 室温放置10～20分钟裂解细菌，其间可以用手轻弹离心管混匀。
   
5. -20℃冷冻至凝固，一般需要1小时。凝固有利于裂解细菌，所以一定要凝固到细菌溶液变成固体。
   
6. 室温水浴解冻。如果裂解充分，细菌释放出的DNA将使裂解物十分粘稠。如果不粘稠，说明裂解不充分，需要重复冻融步骤，否则完整细菌将和包涵体一起沉淀，影响包涵体的纯度。最好在显微镜下检查细菌是否充分裂解。
   
7. 加入25μL的Benzonase核酸酶(1U/μL)，脱色摇床上摇晃直到裂解液不再粘稠，一般需要30分钟左右。
   
   • 检查方式是将裂解物倾倒转移到另一离心管中，在转移过程中看其是否粘稠。
8. 5000～7000rpm 4℃离心5分钟，小心收集上清。上清含有以可溶形式存在的重组蛋白，可以保留作为SDS-PAGE对照样品。
   
9. 将沉淀（主要由包涵体构成）悬浮在25mL的包涵体洗涤液中，轻柔混匀后室温放置5分钟。
   
10. 5000～7000rpm 4℃离心10分钟，小心收集上清，可以作为包涵体第一次洗涤的对照样品。
    
11. 将沉淀（主要由包涵体构成）悬浮在25mL的包涵体洗涤液中，轻柔混匀后室温放置5分钟。
    
12. 5000～7000rpm 4℃离心10分钟，小心收集上清作为包涵体第二次洗涤的对照样品。
    
    • 一般洗涤两次就能够得到足够纯净的包涵体，如果需要更多洗涤，需要用户单独购买包涵体洗涤液。
13. 得到的沉淀即为包涵体，可以长期放置在冰箱待用或直接进入包涵体的溶解步骤。

14. 在包涵体沉淀中加入5mL包涵体溶解液，用枪头充分吹打后漩涡震荡。如果低温放置，包涵体溶解液会产生沉淀，必须45～65℃溶化并混匀后才能使用。
    
15. 室温放置1小时使蛋白质充分溶解。
    
16. 20000g 4℃离心20分钟，小心收集上清，保留不溶性沉淀。
    
    • 检查离心管能否承受此离心力。脱盐处理上清后进行SDS-PAGE检查是否大部分重组蛋白都在上清中。如果没有，说明包涵体没有完全溶解，需要用适当增加包涵体溶解液的用量。
      
    • 包涵体溶解液含6M盐酸胍，溶解蛋白能力强于含8M尿素的溶解液，但SDS-PAGE时不能直接上样，需要先脱盐。客户也可以用自备尿素配制8-10M尿素的溶液（尿素溶液不稳定，所以不能长期放置）溶解包涵体，得到的溶解液可以直接用于SDS-PAGE电泳。但其溶解能力弱于盐酸胍。
17. 得到的脱氧后的蛋白质溶液可以用于复性等试验。由于不同的蛋白质有不同的最佳复性条件，所以本公司不能提供统一的复性溶液，需要用户自己摸索。
    
    • 包涵体纯化过程中引入了溶菌酶、Benzonase等外源蛋白质，在SDS-PAGE分析时可能有额外条带出现。